影響無(wú)菌制劑無(wú)菌保證水平的因素
發(fā)布日期：2022/2/8 16:20:08 訪(fǎng)問(wèn)次數：737
藥品是特殊商品，關(guān)系到人們的生命安全?！端幤飞a(chǎn)質(zhì)量管理規范》 ( good manufacturing practice，GMP) 2010 年修訂附錄1無(wú)菌藥品第三條指出：“無(wú)菌藥品的生產(chǎn)必須嚴格按照精心設計并經(jīng)驗證的方法及規程進(jìn)行，產(chǎn)品的無(wú)菌或其他質(zhì)量特性，決不能依賴(lài)于任何形式的最終處理或成品檢驗 (包括無(wú)菌檢查) ”。筆者從無(wú)菌制劑的特殊性、無(wú)菌檢查方法的局限性、無(wú)菌保證水平、無(wú)菌產(chǎn)品的工藝設計、無(wú)菌安全的保證要素幾個(gè)方面探討提高無(wú)菌安全水平的對策，以完善產(chǎn)品的質(zhì)量保證體系，保證藥品的質(zhì)量、療效和用藥安全。
無(wú)菌制劑的特殊性
無(wú)菌物品是指物品中不含任何活的微生物， 實(shí)際上無(wú)法證明產(chǎn)品中沒(méi)有活的微生物存在， 因為對于任何一批滅菌物品而言， 絕對無(wú)菌既無(wú)法保證也無(wú)法用實(shí)驗來(lái)證實(shí)。一批物品的無(wú)菌特性只能通過(guò)對物品中活的微生物的概率低至某個(gè)可接受的水平來(lái)表達， 即無(wú)菌保證水平 ( sterility assurance level， SAL) 。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，滅菌是指將物品中污染的微生物概率降至預期的無(wú)菌保證水平。最終滅菌物品微生物存活概率，即無(wú)菌保證水平不得高于 10-6。無(wú)菌制劑的生產(chǎn)是一個(gè)完整的操作規則體系， 若其中的任何環(huán)節被疏忽、 被污染，那么其他環(huán)節雖是無(wú)菌操作， 也將完全失去意義，都可能導致藥品生產(chǎn)不符合質(zhì)量要求。
無(wú)菌檢查法的局限性
無(wú)菌檢查法是根據《中華人民共和國藥典》 內容而建立的一種檢查方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規定，僅表明供試品在該檢驗條件下未發(fā)現微生物污染。檢驗結果只是基于“可能性” 的判斷 ， 無(wú)菌檢查方法的局限性在于以下幾個(gè)方面。
1培養液的質(zhì)量
無(wú)菌檢查所用的培養液只是針對真菌和細菌的檢驗， 對結果的判斷也是基于“是否在培養液中生長(cháng)”。
2培養條件
研究表明，《中華人民共和國藥典》 規定的微生物培養條件并不是許多細菌和真菌的最適生長(cháng)條件 。
3實(shí)驗驗證
微生物的生長(cháng)除了受培養液的質(zhì)量、培養條件( 溫度、時(shí)間) ， 還要受檢品特性如檢品有無(wú)抑菌作用、 供試品的處理方法及實(shí)驗操作條件等因素的影響，因此要保證無(wú)菌檢查結果的準確性和可靠性就必須對無(wú)菌檢查的方法進(jìn)行驗證。
4檢驗數量
《中華人民共和國藥典》 規定無(wú)菌檢查是抽樣檢查，一般是從每批產(chǎn)品中抽取一定數量的單位產(chǎn)品組成樣本進(jìn)行無(wú)菌檢查， 以此判斷整批產(chǎn)品是否符合無(wú)菌的要求。無(wú)菌產(chǎn)品的污染率(q) 、 無(wú)菌檢查的取樣量(n) 以及無(wú)菌檢查通過(guò)的概率( p) 之間的關(guān)系可以用如下數學(xué)公式表示: pn = (1-q) n。當固定污染率為 0.1%，抽樣 30 瓶時(shí)通過(guò)無(wú)菌檢查的通過(guò)率為( 1-0.001) 30 = 97.0%， 檢出染菌的概率為3.0%; 抽樣 100 瓶時(shí)， 通過(guò)無(wú)菌檢查的通過(guò)率為( 1-0.001) 100 = 90.5%， 檢出染菌的概率為 9.5%; 抽樣1 000瓶時(shí)，通過(guò)無(wú)菌檢查的通過(guò)率為(1-0.001) 1.000 = 36.8%，檢出染菌的概率為 63.2%。
當固定 30 瓶取樣量， 假定該產(chǎn)品的污染率為 1.0%，通過(guò)計算，該批產(chǎn)品通過(guò)無(wú)菌檢查的通過(guò)率為 74%; 如果該產(chǎn)品的污染率為 0.5%，則通過(guò)無(wú)菌檢查的通過(guò)率為 86%。通過(guò)以上數據可以看出: 樣本污染微生物的比例越低， 抽樣樣本通過(guò)無(wú)菌檢查的通過(guò)率就越高，即使增大抽樣量也很難檢查出污染的部分。因為無(wú)菌檢查法是一項破壞性實(shí)驗，因此不可能對整批產(chǎn)品進(jìn)行 100%的檢驗，基于抽樣檢驗的無(wú)菌檢查，存在的局限性是很明顯的。雖然產(chǎn)品的無(wú)菌檢查按《中華人民共和國藥典》 規定檢查合格，但不能得出產(chǎn)品絕對無(wú)菌的結論，這已是一個(gè)共識。
無(wú)菌保證水平
2010 版《中華人民共和國藥典》 將終端產(chǎn)品的無(wú)菌保證要求規定為微生物污染概率不超過(guò)百萬(wàn)分之一，而采用無(wú)菌制造工藝，其無(wú)菌保證水平則為微生物污染概率不超過(guò)千分之一。以過(guò)濾除菌法為例。過(guò)濾除菌法：常用于氣體 熱不穩定的藥品液體或原料的除菌。
過(guò)濾過(guò)程中無(wú)菌保證與過(guò)濾液體的初始生物負荷及過(guò) 濾器的對數下降值 ( log reduction value，LRV) 有關(guān)，LRV 系指規定條件下，被過(guò)濾液體過(guò)濾前的微生物數量與過(guò)濾后的微生物數量比的常用對數值。即: LRV = LgN0-LgN。式中: N0 為產(chǎn)品過(guò)濾前的微生物數量，N為產(chǎn)品過(guò)濾后的微生物數量。每平方厘米有效過(guò)濾面積的 LRV 可以達到 7， 即過(guò)濾器上游每平方厘米有107個(gè)菌，下游可以達到 1個(gè)菌的水平。
除菌過(guò)濾器本身的除菌效率可以達到10-7水平，但是，由于人員操作及環(huán)境因素的影響， 產(chǎn)品最終的無(wú)菌保證一般只能達到10-3 水平， 遠遠低于除菌過(guò)濾本身的水平。此外除菌過(guò)濾器不能將病毒或支原體全部濾除，所以對于除菌過(guò)濾法，其生產(chǎn)系統應嚴格符合無(wú)菌生產(chǎn)的 GMP 要求。GMP2010 年修訂附錄 1無(wú)菌藥品第五十二條: 應當盡可能減少物料的微生物污染程度。
第五十八條: 應當根據所用滅菌方法的效果，確定滅菌前產(chǎn)品微生物污染水平的監控標準，并且定期監控。因此《藥品 GMP 指南》 ( 無(wú)菌藥品，2010 年修訂) 在第 6 節藥液的配制中提出: 對于固體溶解并進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾的產(chǎn)品而言， 起始物料的微生物污染水平應進(jìn)行控制，通常為100 cfu·g-1[菌落形成單位數(colony forming units，cfu)]，除菌過(guò)濾前非最終滅菌產(chǎn)品的微生物限度標準一般為 10 cfu /100 mL。
無(wú)菌產(chǎn)品的工藝設計
無(wú)菌生產(chǎn)工藝就是必須在無(wú)菌控制條件下生產(chǎn)無(wú)菌制劑的方法，無(wú)菌產(chǎn)品分兩大類(lèi)即無(wú)菌分裝的產(chǎn)品和最終滅菌的產(chǎn)品。無(wú)論是哪一類(lèi)無(wú)菌產(chǎn)品， 無(wú)菌生產(chǎn)工藝都應嚴密監控生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度， 并應在無(wú)菌控制的環(huán)境下才能操作。采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝， 首先在劑型的選擇上應選擇無(wú)菌保證水平高的劑型。如果主藥在水中穩定，但不能耐受濕熱滅菌，則不宜開(kāi)發(fā)成大容量注射劑，可以開(kāi)發(fā)成小容量注射劑或凍干粉針，因為采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝制備大容量注射劑因灌裝時(shí)間長(cháng)，染菌的風(fēng)險就大大提高。在其生產(chǎn)過(guò)程中，應定期對無(wú)菌生產(chǎn)工藝進(jìn)行驗證， 驗證內容包括環(huán)境空氣過(guò)濾系統有效性、工藝用水系統、設備和人員清潔及培養液模擬灌裝實(shí)驗等。
無(wú)菌安全的保證要素
無(wú)菌安全實(shí)際上就是避免染菌， 如果在生產(chǎn)過(guò)程中能避免已滅菌的容器設備等受到二次污染就能保證產(chǎn)品的無(wú)菌安全。微生物的來(lái)源主要有以下 3 種。
1人員
人是潔凈區環(huán)境的最大污染源， 因為人員幾乎涉及到所有的生產(chǎn)步驟，人員的活動(dòng)量將直接影響整個(gè)潔凈區的環(huán)境質(zhì)量，在無(wú)菌室由操作人員引起的污染將達到總污染原因的 95% 。研究表明，潔凈室內的工作人員穿無(wú)菌服時(shí)，靜止狀態(tài)的發(fā)菌量一般為每人每分鐘 10 ～ 300 個(gè)， 軀體一般活動(dòng)狀態(tài)為每人每分鐘150～1 000 個(gè)，快步行走狀態(tài)為每人每分鐘 900 ～ 2 500個(gè)，咳嗽一次一般為每人每分鐘 70～700 個(gè)，噴嚏一次一般為每人每分鐘 4 000 ～ 62 000 個(gè)。通過(guò)對上海地區無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)的核心生產(chǎn)區( 即動(dòng)態(tài) A /B 或 A /C級) 環(huán)境中微生物的污染采樣，共收集到微生物分離株265 株，A 級區共收集到 63 株， 占污染微生物總數的23.8%，在 A 級區的微生物污染物類(lèi)型較多、 較復雜。不同潔凈級別區域之間的空氣微生物污染程度由低級別向高級別遞減，但表面微生物污染程度在各潔凈級別之間的差異不大。這說(shuō)明空氣凈化和物理隔離可以有效阻斷大部分微生物的傳播，但接觸和操作引起的污染仍是生產(chǎn)企業(yè)面臨的主要問(wèn)題。
2工藝用水
注射用水與注射劑在生產(chǎn)過(guò)程中污染可能性最高的發(fā)熱性物質(zhì)就是細菌內毒素。細菌內毒素由革蘭陰性菌產(chǎn)生， 而水源性微生物絕大多數為革蘭陰性菌，這類(lèi)微生物不會(huì )形成芽孢， 故不耐熱， 通過(guò)滅菌手段可將其殺死， 但該類(lèi)細菌的細胞壁外層上有一層特殊的結構， 它在細菌生長(cháng)繁殖過(guò)程中并不分泌到介質(zhì)中，也不能從外壁上自然脫落，不是細菌的代謝產(chǎn)物，當細菌死亡、解體后才顯示出一系列內毒素的生物活性。細菌內毒素具有耐熱性， 需用干熱滅菌(250 ℃，30min 以上)才能去除。細菌內毒素會(huì )使人致病甚至死亡，對藥品質(zhì)量產(chǎn)生不良的影響。
3環(huán)境
空氣中的微生物基本為革蘭陽(yáng)性菌，根據有關(guān)的資料報道 : 人葡萄球菌和唾液鏈球菌為人體攜帶的常見(jiàn)菌種，而沃氏葡萄球菌、藤黃微球菌和芽孢桿菌均為常見(jiàn)環(huán)境菌。產(chǎn)生芽孢的細菌都是革蘭陽(yáng)性菌 ，芽孢對熱、干燥、輻射、化學(xué)、消毒劑等理化因素均有強大的抵抗力，其中含有吡啶二羧酸鈣，更增加了對熱的抵抗力。如果芽孢被環(huán)境中的塵埃包圍， 這類(lèi)芽孢的耐熱性可能會(huì )更強，更不易被殺死。
提高無(wú)菌安全水平的對策
1重視無(wú)菌檢查法的方法學(xué)驗證
無(wú)菌檢查法常見(jiàn)的問(wèn)題： 對檢驗方法的驗證、 培養時(shí)間的選擇和結果判斷缺乏系統的評價(jià)。所以，應綜合分析實(shí)驗中遇到的所有情況，最終形成一份詳細的、嚴謹、具有可操作性的驗證報告，并且建立該品種的標準操作規程( standard operation procedure， SOP) ，在規程中應對樣品的取樣量、無(wú)菌檢查方法的選擇、集菌培養器的型號、稀釋劑及沖洗液的選擇、每次沖洗液的用量和沖洗次數都應有說(shuō)明。研究表明， 同一品種使用適于抗菌性供試品專(zhuān)用培養器( KSF330， 0.45 μm) 比使用適于非抗菌性供試品普通培養器 ( CN330， 0.22 μm;PY330，0.45 μm) 所需沖洗量少一半; 不同的品種所需的沖洗量不同，選擇不同的沖洗液所需的沖洗量不同。對待無(wú)菌檢查結果要進(jìn)行科學(xué)分析， 如果無(wú)菌檢查結果合格，不能得出該批產(chǎn)品絕對無(wú)菌的結論，如果無(wú)菌檢查不合格，則可以判定該批產(chǎn)品染菌的結論。不能出現假陰性( 陽(yáng)性對照為陰性) 時(shí)漏檢， 當結果為陽(yáng)性時(shí)，違反《中華人民共和國藥典》 規定進(jìn)行復檢。
2全面、細致、周到的質(zhì)量管理
目前已經(jīng)過(guò)了 GMP認證的無(wú)菌制劑生產(chǎn)企業(yè)，均建立了完善的質(zhì)量管理體系和一系列管理制度。但任何一項規章制度都無(wú)法阻止違規現象的發(fā)生，能否有效執行是關(guān)鍵。在生產(chǎn)中可能會(huì )出現很多違規現象，但是在管理方面卻沒(méi)有任何的證據。例如對傳遞窗使用的管理，傳遞窗的作用就是防止物品在傳遞過(guò)程中受到污染和避免交叉污染，對傳遞窗的使用有幾個(gè)要求: 傳遞窗的自?xún)魰r(shí)間、 紫外線(xiàn)的照度及照射時(shí)間。而現在多數的傳遞窗的按鈕設置就是一個(gè)最基本的電源開(kāi)關(guān)，工作人員自行操作時(shí)會(huì )嚴格按標準操作規程執行嗎? 如自?xún)魰r(shí)間確認為30 min，有些操作人員為了趕時(shí)間， 只用15 min。再例如， 對于無(wú)菌操作間，進(jìn)入人員的數量是有嚴格規定的， 但有時(shí)車(chē)間為了趕進(jìn)度或由于其他原因可能會(huì )增加人數，這些操作都是違規的，所以為了能全面、細致、周到地執行和實(shí)施GMP，建議從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)。
人員培訓
GMP 培訓是提高藥品生產(chǎn)企業(yè)人員素質(zhì)的有效手段， 人員素質(zhì)的不斷提高是保證藥品質(zhì)量的基礎。應對員工開(kāi)展各類(lèi)培訓， 對不同員工所在崗位需要掌握的知識和技能進(jìn)行針對性培訓， 對培訓效果進(jìn)行考核。保障員工掌握本崗位的基本理論知識、 操作規程和實(shí)際操作技能。同時(shí)，要經(jīng)常對員工進(jìn)行藥害事件的宣傳教育工作，增強責任心，使其在工作中自覺(jué)地按照標準操作規程操作 。無(wú)菌藥品的微生物污染是影響藥品生產(chǎn)質(zhì)量和引發(fā)不良反應事件的主要因素之一。微生物是無(wú)處不在、 無(wú)孔不入的， 反復進(jìn)行無(wú)菌概念的培訓是加強無(wú)菌概念的有效辦法。反思現行的無(wú)菌培訓， 內容多是微生物學(xué)和進(jìn)出潔凈室的規程，由于操作規程中不可能事無(wú)巨細，員工在實(shí)際生產(chǎn)中遇到規程中沒(méi)有規定的情況， 常常會(huì )違反無(wú)菌操作的原則[ 11] 。特別要加強對外部施工人員和維修人員的培訓工作， 當他們在生產(chǎn)期間需進(jìn)入生產(chǎn)潔凈區時(shí)應當對其進(jìn)行詳細的指導和監督。在實(shí)際生產(chǎn)中，往往會(huì )出現這樣的情況， 當設備出現小故障時(shí)， 為了使生產(chǎn)能正常進(jìn)行，或者出于迫切完成任務(wù)的考慮，維修人員會(huì )做出一些違規動(dòng)作， 如果沒(méi)有較強的無(wú)菌
概念，就會(huì )導致污染。
工藝用水
有效控制水系統的微生物污染水平及細菌內毒素的水平， 企業(yè)內部應設立警戒水平及糾偏限度，以便及時(shí)發(fā)現不良趨勢，采取相應措施。
環(huán)境管理
環(huán)境管理的主要思想是防止污染和交叉污染。生產(chǎn)環(huán)境包括: 空氣、 設備、 設施以及操作人員。環(huán)境監測是用來(lái)評估生產(chǎn)環(huán)境控制是否有效的一個(gè)工具。檢測項目包括懸浮粒子、 空氣浮游菌、 沉降菌、 設備和設施表面的微生物以及操作人員的衛生狀況監測等。環(huán)境中懸浮粒子的有效控制， 在很大程度上解除了塵埃包裹芽孢的可能， 避免了難以滅菌的風(fēng)險。沉降菌、 浮游菌及表面微生物這 3 種監測的原理是不同的，針對不同的微生物， 不能完全相互替代。通過(guò)對潔凈室 /區空氣、 設備、 設施表面以及操作人員表面微生物的采集， 除了通過(guò)菌落計數了解微生物的濃度外，還應包括對培養出來(lái)的污染微生物進(jìn)行鑒別，通過(guò)鑒別可了解潔凈室的清潔、 消毒步驟的有效性或缺陷性，特別是對消毒劑有效性評估有所幫助，微生物鑒別的結果也對調查和消除污染源有幫助。
設備的管理
在企業(yè)的生產(chǎn)過(guò)程中，設備與設施如同戰場(chǎng)上的武器一樣，平時(shí)必須要注重保養和維護，并且要制定有效的短、 中期維修計劃，確保設備正常運行，這樣才能在實(shí)際操作中發(fā)揮良好的作用，不會(huì )給生產(chǎn)帶來(lái)負面影響。
3注重無(wú)菌生產(chǎn)工藝驗證
要定期進(jìn)行培養液模擬灌裝驗證，證明經(jīng)過(guò)完整的生產(chǎn)過(guò)程，產(chǎn)品污染率的目標為零。培養液模擬灌裝在某種意義上是一種挑戰性實(shí)驗，使用培養液作為藥品的替代品進(jìn)行無(wú)菌模擬生產(chǎn)，對無(wú)菌工藝進(jìn)行驗證。因為幾乎在所有情況下，微生物在培養液中的繁殖和生長(cháng)比在實(shí)際產(chǎn)品中更容易。GMP( 2010 年修訂) 附錄 1 無(wú)菌藥品中第四十七條提出: 培養液模擬灌裝實(shí)驗的首次驗證，每班次應當連續進(jìn)行 3 次合格實(shí)驗， 空氣凈化系統、 設備、 生產(chǎn)工藝及人員重大變更后，應當重復進(jìn)行培養液模擬灌裝實(shí)驗，培養液模擬灌裝實(shí)驗通常應當按照生產(chǎn)工藝每班次半年進(jìn)行一次，每次至少一批。
4現場(chǎng)監督
現場(chǎng)監督是質(zhì)量保證(quality assurance，QA) 的一部分。QA就是為了滿(mǎn)足品質(zhì)的要求而進(jìn)行的全面有效的質(zhì)量管理活動(dòng)。QA人員的主要職責就是對生產(chǎn)全過(guò)程進(jìn)行控制， 糾正生產(chǎn)過(guò)程中出現的差錯及不規范行為， 做到防患于未然。QA人員工作的性質(zhì)就是要找別人的缺點(diǎn)與不足，為了起到警示作用還必須對不規范行為進(jìn)行扣罰。QA人員最容易犯的錯誤就是遇見(jiàn)問(wèn)題總是搬出文件規定，命令操作人員執行，當生產(chǎn)過(guò)程中出現異常情況時(shí)也只會(huì )讓操作人員停下來(lái)并且一味強調要如何處分或者威脅當事人，這樣說(shuō)和做的結果不僅不能解決問(wèn)題，反而會(huì )增加當事人對QA人員的反感， 以后 QA人員的管理工作會(huì )更難開(kāi)展。
更可怕的是操作人員會(huì )有意隱瞞生產(chǎn)現場(chǎng)的任何問(wèn)題， 這樣一來(lái)質(zhì)量風(fēng)險會(huì )越來(lái)越大。GMP 規范和《中國人民共和國藥典》的標準是不可逾越的，為此需要尋找各種可行的辦法， 所以要求 QA人員必須具有理論知識和實(shí)踐經(jīng)驗，既精通GMP法規，熟知生產(chǎn)工藝，又要懂得設備的操作，并且還要具有良好的與人溝通的能力。在現場(chǎng)發(fā)現問(wèn)題時(shí)，QA人員能和操作人員共同分析問(wèn)題， 從根本上幫助操作人員解決問(wèn)題， 得到操作人員的理解和尊重，這樣才能使QA工作進(jìn)入良性循環(huán)。
